Zhou Gang Zhao Linna Wang Xueshuo Liu Na Liu Zongyin Cao Huimin Lin Lan Cui Shenghui
Inner Mongolia Institutes for Drug Control National Institutes for Food and Drug Control Shandong Ruian Pharmaceutical Company Limited
复方多粘菌素B软膏为临床用于预防皮肤割伤、擦伤、烧烫伤、手术伤口等创面细菌感染的外用制剂，其中的有效抗菌成分一般为硫酸多粘菌素B、硫酸新霉素和杆菌肽，不同厂家的产品中这3种抗生素的用量存在一定差异。由于3种抗生素在抗菌谱上存在一定的互补性，该软膏在临床上对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌均显示了良好的抗菌效果[1-2]。
目前，国内外不同企业均生产复方多粘菌素B软膏，后继上市的品种需要与市场上已有产品进行体外抗菌效果的对比评价。但截至目前，国内外尚没有规范的针对复方多粘菌素B软膏体外抗菌效果评价用菌种库、测试方法和数据分析方法。本文结合美国临床和实验室标准协会（Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI）推荐的琼脂稀释法[3]，对软膏样品的前处理进行了针对性优化，并使用近期从临床收集的皮肤感染常见不同种属微生物，对待评价软膏与市场上不同厂家生产的复方多粘菌素B软膏外用制剂的抗菌效能差异进行了系统评价。
评价研究用的4个软膏制剂和待评价软膏制剂信息见表1。
本次评价研究共计使用11个种属72株细菌，其中临床分离菌种67株，本实验保存的标准菌种5株，见表2。
Thermo 1389生物安全柜和Thermo 205050GC恒温培养箱购自美国Thermo公司；VITEK COMPACT2全自动微生物分析系统购自法国梅里埃公司；基质辅助飞行时间质谱（MALDI-TOF,MS）购自德国Bruker公司；MH琼脂和胰蛋白胨大豆琼脂（Tryptone Soybean Agar,TSA）购自美国BD公司；PBS(pH=7.4)-0.1%Tween 80购自美国Thermo公司；生理盐水购自国药集团。
取-80℃保存于50/50%BHI-甘油的菌种一环，在TSA平板上分区划线，于36℃培养20～24小时后，取单个菌落在TSA平板上再次分区划线培养，取单菌落用MALDI-TOF MS和VITEK COMPACT 2进行菌种的种属确认。
分别称取不同厂家生产的软膏外用制剂2.56 g于50 mL离心管中，加入40 mL PBS(pH=7.4)-0.1%Tween 80,50℃水浴震荡至样品充分溶解混匀，得到64 mg/mL受试物备用。
采用美国临床和实验室标准协会（Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI）推荐的琼脂稀释法，对不同厂家生产的软膏外用制剂MIC进行测定。具体方法如下：取步骤“1.5”项下配制的浓度为64 mg·mL-1受试物5 mL，加入MH琼脂至20mL，配制16 mg·mL-1的MH琼脂平板，而后用PBS(pH=7.4)-0.1%Tween 80稀释的样品，分别配制含制剂浓度为8、4、2、1、0.5、0.125、0.0625、0.031、0.015和0.007 mg·mL-1的MH琼脂平板。用无菌棉签取新鲜TSA平板二代培养物，加入无菌生理盐水中，制备1.5～2.0麦氏浊度的菌悬液。将上述菌悬液在生理盐水中进行1∶10倍稀释，取稀释后的菌悬液1μL，用多点接种仪接种于MH琼脂表面，于36℃培养20～24小时后，肉眼观察MH琼脂上是否有微生物生长。逐个记录每个菌种对每种制剂的最低不生长浓度，该浓度即为制剂对该菌种的MIC。
用SPSS软件的Wilcoxon符号秩检验，配对分析待评价制剂与其他公司生产的软膏制剂对不同菌种的MIC值差异。
由表2、3可见，待评价制剂对11个种属72株细菌MIC的第50百分位数为0.5 mg·mL-1，当浓度达到16 mg·mL-1时，可对被测试的11个种属72株细菌均形成有效抑制。经统计分析发现，待评价制剂MIC与国产制剂X和Y的MICs间未见显著性差异（P>0.05）。
待评价制剂MIC极显著低于进口制剂B的MIC(P<0.01）。在所测试的72株细菌中，19株细菌（11株革兰氏阳性菌、8株革兰氏阴性菌）的MIC未见差异；待评价制剂对42株细菌（25株革兰氏阳性菌、17株革兰氏阴性菌）的MIC比进口制剂B低2～128倍。
待评价制剂的MIC极显著高于进口制剂A(P<0.01）。在所测试的72株细菌中，38株细菌（28株革兰氏阳性菌、10株革兰氏阴性菌）的MIC未见差异；待评价制剂对30株细菌（19株革兰氏阳性菌、11株革兰氏阴性菌）的MIC比进口制剂A的MIC高2～8倍。
表3 不同软膏制剂对细菌MICs百分位数分布
本文首次搭建了复方多粘菌素B软膏外用制剂体外抗菌效果评价用菌种库，建立了适用于CLSI推荐的琼脂稀释法测定用的软膏前处理方法，并结合适当的数据统计方法对不同制剂进行了对比评价。结果显示，此评价系统可有效识别不同制剂之间由于配方不同引起的抗菌效果差异，为今后复方多粘菌素B软膏外用制剂体外抗菌效果评价提供了有效的方法和数据参考。
评价用菌种是复方多粘菌素B软膏外用制剂抗菌效果评价的重要工具，其种属和数量构成会直接影响评价的结果。本研究选择了来源广泛的皮肤感染常见临床菌种，包括金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、屎肠球菌、粪肠球菌、无乳链球菌、化脓性链球菌、大肠埃希氏菌、肺炎克雷伯菌、阴沟肠杆菌、奇异变形菌、铜绿假单胞菌，并使用MALDI-TOF MS和VITEK COMPACT 2全自动微生物分析系统对这些菌种进行了种属确认，从菌种数量、种类和质量上保障了评价结果的准确性。
国际上已有规范的抗生素体外药敏分析方法，其中微量肉汤稀释法和琼脂稀释法是常用的经典方法[3]。鉴于复方多粘菌素B软膏外用制剂样品在常温下为膏状，而在50℃则融化为液体，本文选择了琼脂稀释法进行评价，在50℃将软膏和MH琼脂直接混合，待平板凝固后，抑菌物质会在琼脂中均匀扩散，而后将约104CFU的待测菌种点种于琼脂平面，培养后评价软膏制剂的抑菌效果，这从客观上规避了提取过程对制剂中抗菌成分的损失，从而更准确地反映不同制剂的抗菌效果。
鉴于琼脂稀释法所得结果为2倍差异的离散数据，T-检验等常规统计方法不适于该类数据的分析。本文选择了Wilcoxon符号秩检验方法，可实现离散数据的配对分析，结果显示，该方法有效识别出了配方差异带来的抑菌效果差异。评价结果显示待评价制剂与国产制剂X和Y中有效抗菌成分含量一致，这3个制剂对被测试的11个种属72株细菌的MICs间未见显著性差异（P>0.05）。而待评价制剂MIC极显著高于进口制剂A的MIC主要是革兰氏阴性菌MIC差异造成。进口制剂A组方中的多粘菌素B比待评价制剂高1倍，而多粘菌素B主要对革兰氏阴性菌有抗菌性[4]，此差异应为两制剂MIC显著不同的主要原因。待评价制剂MIC极显著低于进口制剂B的MIC的主要原因应为进口制剂B组方中缺少新霉素，该抗生素对革兰氏阴性和阳性细菌具有较为广谱的抗菌效果[5]。
综上，本文初步建立了复方多粘菌素B软膏外用制剂体外抗菌效果评价用的菌种库和评价方法，该方法可有效识别不同制剂之间由于抗菌成分配方不同引起的抗菌效果差异，对今后复方多粘菌素B软膏外用制剂体外抗菌效果评价提供了有效的数据和方法参考。
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